假阴性判断：造成假阴性结果的原因有很多，主要体现在FAM扩增曲线不起来，原因包括标本抑制，核酸提取失败，基因突变以及仪器故障等。 目前国内主流PCR试剂都不带内标监控功能，用于检测目标基因的FAM扩增曲线既用来定量又用于定性（判断阴阳性），因此FAM扩增曲线的好坏非常关键。对于此类无内标试剂，建议结合乙肝血清标志物结果（五项定量/定性结果）来判断阴阳性，即使是FAM曲线有扩增也应该参考此结果，特别是E抗原结果。同时，对于拥有竞争性内标监控功能的试剂来说，可有以下四种情况发生：如FAM无扩增，内标有扩增：结果正常，判断该样本为阴性结果；如FAM无扩增，内标也无扩增：结果异常，可能原因核酸提取失败或有抑制，一定要重复实验；如FAM有扩增，内标有扩增：结果正常，因为待测核酸和内标在同一反应体系下扩增；如FAM有扩增，内标无扩增：结果正常，强阳性样本会抑制内标的扩增，导致内标结果偏弱或阴性。 假阳性判断（如何判定）：临床PCR检测当中造成假阳性结果的情况比较少，原因包括试剂污染，气溶胶污染，操作污染，扩增产物污染，非特异性扩增，耗材污染等，所以建议一定要做阴性对照来监控是否存在污染。

首先简单来说，IU/ml和copies/ml是没有直接关系的，IU/ml是国际标准物质的表述单位，copies/ml是各检测方法对结果的表述单位的一种，可参见李金明《实时荧光PCR技术》P177。所谓的International Unit（IU），是为了统一各个检测方法而设定的单位。本身PCR检测的拷贝数是无法绝对定量的，可以理解为，为了统一标准，WHO制定标准物质，赋予其IU值，发放给各个PCR试剂厂商，让他们把各自检测结果和标准物质比较，从而得出各自的换算系数。比如分发的是1IU的标准物质，罗氏测的是2copy，那罗氏的换算系数是2（2copies=1 IU），雅培的是20copy,那雅培的就是20（20copies=1 IU），由此可见，各个方法的转换系数是不一样的。其次，因为各实验方法检测结果的表述单位存在多样化，如copies/ml，geq/ml等，使得检测结果没有可比性，因而WHO应用国际单位IU作为统一的表述单位，使不同实验室、不同检测方法得出的检测结果的表述单位得到统一并具有了可比性。最后，具体每种方法的检测结果与IU的关系，可以通过同时检测WHO的标准物质，然后根据其与标准物质的比例关系，来找到不同检测方法IU与copies之间的关系。

  由于传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差。同一个模板在96孔PCR仪上做96次重复实验，所得结果有很大差异，因此无法直接从终点产物推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。但即使如此，传统的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。  内标定量：若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则PCR反应变为双重PCR，他们之间存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标，也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。  外标定量：外标法不是把标准物质加入到被测样品中，而是与被测样品在相同条件下进行检测。由于在荧光定量PCR中，Ct值与起始模板的对数存在线性关系，因此可以利用标准曲线对未知样品进行定量测定，并且在PCR循环刚刚进入真正的指数扩增期时，Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的，因此定量的结果也会准确很多。  美国Texas大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。【Ke LD, Chen Z, Yung WK.A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol.Cell Probes,2000,14(2):127-135】

采用Levey-Jerming质控图, 以X±2SD警告线，X±3SD为失控线。质控点落在x±3S之外时，首先采取的措施是复检，复检的目的主要是用于查明人为误差，也可以查出偶然误差，如果是偶然误差，重测的结果应在允许范围内。同时还在观察标准曲线的生成情况，扩增效率的高低，曲线梯并是否良好，曲线形态是否标准，Ct值是否有飘移，还要结合临床标本的检测结果，是否有高值和低值，来区分是试剂造成的失控还是操作不当、仪器故障或老化造成的失控。若临床标本测定结果的曲线标准，测量值有高有低，同时检测的试剂空白及阴性质控均在控，很有可能是标准品质量有问题，如降解、更换试剂型号等情况发生造成的。  对于连续7个质控点落在均值之一侧，若均未超出X±3s范围时，认为存在系统误差，但检测结果仍可发出；若连续7个质控点落在均值之一侧，而且质控数据有超出X±3s范围的趋势时(逐渐升高或逐渐降低)，一定要联络仪器工程师，及时校准仪器。

（1）实验室整体布局：根据卫生部颁发的《临床基因扩增检验实验室管理暂行办法》（卫医发[2002]10号）要求，临床基因扩增检验室原则上分为四个单独的工作区域：试剂贮存和准备区，标本制备区，扩增区，产物分析区，也可以将后两个区域合为一个区，即扩增及产物分析区。实验室设计时按照《办法》规定，三个区域相互独立，并有各自的缓冲区域。

（2）各工作区域仪器设备各工作区域的仪器设备及物品，包括椅子、办公用品、清洁用品等均不能拿出本区域，所有可移动物品均应有本区域的标示。  

各区域应具备的设备配置为：屋顶紫外灯、近台紫外灯、一次性手套、一次性鞋套、工作服、废液缸、扫帚、拖把、废纸篓、微量加样器（覆盖1-1000ul），经高压处理的离心管和加样器吸头（带滤芯）、笔、纸等。各工作区域的特殊配置包括：

（1）试剂贮存和准备区：2～8℃冰箱、漩涡震荡器、超净工作台。

（2）标本制备：2～8℃冰箱、-20℃冰箱、高速台式冷冻离心机、漩涡震荡器、金属加热模块、超净工作台。

（3）扩增及产物分析区：荧光定量核酸扩增仪、电脑、打印机。

 同时：进入各工作区域必须严格按照单一流向，并用明显的箭头表示，各区域用不同的颜色以示区别。即试剂贮存和设备区（蓝色）→标本制备区（白色）→扩增及产物分析区（粉色）。

1、仪器使用的广泛程度  

如果不是一个新出现的仪器品牌，为保证所购置的仪器有充分的可靠性，临床PCR实验室可以从相应仪器在国内外使用的广泛程度来判断。应用越是广泛的仪器，越是经过实践验证的，也就越具有可靠性。

2、仪器的检测通量（反应孔数）  

在购买定量PCR仪的时候需要根据实验室的要求来选择不同通量的仪器。目前市面上的荧光定量PCR仪的检测通量小到16多到384孔，实验室可以根据自己的检测项目和发展状况，选择合适的仪器，没必要追求最昂贵的仪器，一般来说，96孔的通量足够用了；如需寻找新药靶点和疾病标记等类型的实验，则可以考虑购买384孔的仪器。

3、仪器的通道数量  

随着医院开展的项目越来越多，比如基因表达，单核苷酸多态性分析、高分辨率熔解曲线等，那么单通道的仪器则无法满足实验室的需求了，而多通道的设计则能使其更方便地检测多重PCR检测及其衍生的基因表达等其他分析模式。

4、耗材的开放性  

耗材如扩增反应管的开放性可能会决定日常检测成本的高低。作为临床PCR实验室，在选择实时荧光PCR仪时，可考虑这一点。不过对于检测HCV等RNA项目的时候，尽量使用去RNAnase酶耗材。

5、硬件设计特点  

荧光定量PCR仪主要有96孔板式和离心式等，每种设计都有它的独到之处，但也都有无法避免的缺陷。  

96孔板的荧光定量PCR仪可以容纳的样本量大，最大可至100ul，而且无需特殊的耗材。传统的96孔板仪器多采用卤钨灯激发、CCD检测。其优点在于：卤钨灯的光强比LED灯强，波长范围广，对于荧光染料的激发具有非常好的效果，性能比较稳定，使用寿命约3000个小时左右；但CCD的检测通常会因为每个样品孔距光源和检测器的光程各不相同，会产生边缘效应，对结果产生一定的影响。为了保证精确、精准的实验结果，这类仪器在实验过程中通常需要配合ROX校正染料，来平衡孔间差异；离心式的仪器通常选用LED激发、PMT检测，设计上避免了边缘效应，同时PMT检测对荧光信号可以放大或缩小，相对于CCD检测更加灵活，灵敏度更高；但LED的荧光强度比较弱，波长范围也比较窄，因此，对荧光染料的激发效果不如卤钨灯；

6、运行速度  

在荧光定量PCR仪的众多技术参数中，升降温速度也是非常重要的。更快的升降温，可以缩短反应进行的时间，而且缩短了可能的非特异性结合和反应时间，提高PCR的特异性。但是，运行速度越快，对加热制冷模块的要求越高，因此，稳定性是其存在的最大问题，如果在市面上经过长期考证的，稳定性好的仪器，运行速度越快，带来的便捷越多；

7、灵活性  

在仪器基本性能得到保证的情况下，另外一方面则需要考虑仪器的灵活性，主要包括：仪器运输的灵活性，拆卸的灵活性，软件升级的灵活性，模块更换的灵活性以及使用的灵活性等。

现在临床PCR实验室使用的试剂大部分都是各生产企业提供的商品化的试剂盒，那么试剂质量的好坏直接决定了实验结果的好坏，而不同厂家试剂的性能、质量和价格千差万别，如何选择一款合适的试剂对每个PCR实验室都至关重要，一般来说，选择试剂主要从以下几个方面进行评价：

1、重复性  

首先，试剂检测结果的重复性直接展现了试剂的方法学及其质量的好坏，是评价试剂好坏最明显、最直接的指标。  

其次，我们在此说的试剂重复性是指对原始样本检测的重复性，而不是对某一个样本提取的核酸进行重复性的检测和评价。  

最后，试剂的重复性对于疗效检测、用药指导有着重大的意义，一个重复性好的试剂，往往能够在病人的抗病毒治疗过程中，给医生和病人提供最直接、最可靠的数据，让医生和病人对疾病进展有更清楚的认识，从而制定合理的治疗方案，实现更好的治疗效果。

2、灵敏度  

一个试剂的灵敏度往往能够体现该试剂的技术水平和先进程度，同时对于临床病症的监测有着举足轻重的意义。以乙肝为例来说，我国的乙肝复发率远远大于发达国家，同时由乙肝病毒感染转换为慢性肝炎、肝硬化、肝癌的患者也居世界前列，这很大程度上与对低载量病毒监控的严重不足有关。美国肝病学会专家组就提出，对乙肝抗病毒治疗过程中，HBV DNA的最低监测点应设置为10IU/ml，而欧洲和亚太肝病学也指出HBV DNA病毒载量应该尽可能小于10IU/ml。这都足以证明，高灵敏度对于用药治疗、病程监控等起着巨大的作用，灵敏度越高，对于疾病的监控效果更好，对于确定治疗的终点，具有积极的指导作用。

3、定量准确性  

对于临床检测中定量项目来说，试剂盒定量的准确性是非常重要的，也是评价定量试剂盒的一个重要指标之一。卫生部每年都会有2次全国性的室间质评，通过质评结果可以很好的看出试剂盒定量的准确性。  但往往很多时候，实验室在选择试剂的时候都偏重与过去的试剂盒比较定量结果的差异，并以过去的试剂盒定值作为标准来参考和评价一种新试剂，其实这种方法不完全可取。不过可以通过同时检测卫生部的质控品来进行比较，这样才使得两种试剂在同一客观标准上进行PK，得到合理公平的评价。  

同时，要验证一个试剂的定量是否准确，我们可以采用一个高浓度样本，用阴性血清依次进行10倍梯度的稀释，然后选取多家试剂公司的产品进行同步检测PK，考察各公司试剂对样本定值的实际值与理论值的差异，即可判断各公司试剂定量准确与否。 

4、有无内标监测  

内标的一个最主要的作用就是控制假阴性结果的发生，但在国内临床检测中往往被忽视了，这主要与两个方面有关，一个是之前国内使用的很多荧光定量PCR仪均为单通道的仪器，无法进行多色荧光的检测；国内外PCR行业对内标的研究已不是一个新兴课题，目前国内PCR行业能把内标做得非常好的科研单位或商业化的PCR试剂厂家寥寥无几，这正体现了这一技术的难度。  

在临床检测中，内标的作用非常重要。在临床检测过程中，怎么做到每一个阴性结果均为真正的阴性结果，从而杜绝因扩增抑制而出现的假阴性结果呢？内标的加入就能够很好的防止假阴性结果了，加入我们做了一个样本，它的目标检测荧光为阴性，内标检测荧光也为阴性，那么这个样本的扩增则受到了抑制，该阴性结果为假阴性，我们必须对该样本进行复检。如果试剂没有内标的话，我们则不能很好的判断该结果是否正常？是否可以发报告？在发报告时，我们无法保证发出去的结果百分之百的准确；内标的加入，就可以解决我们这方面的烦恼。目前，卫生部的专家也在大力推崇内标的重要性，也是为了保证检验结果的准确可靠。

5、线性定量范围  

试剂盒的线性定量范围指的是试剂盒最低检测下限和最高检测上限之间的范围，范围越宽说明试剂盒性能越好。

6、UNG酶防污染体系  

PCR反应过程中， 1个拷贝的DNA经过30个循环后，可以增长到10亿个拷贝的产物DNA， 极微量的PCR 产物污染，就可能造成假阳性，因而这是一个值得特别重视的问题。尿嘧啶糖苷酶（UNG）法：将PCR 产物中的dT用dU 代替。这种dU 化的PCR 产物与UNG 一起孵育，因UNG 可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU 而阻止TaqDNA 聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。UNG 对不含dU 的模板无任何影响，UNG 可从单或双链DNA 中消除尿嘧啶，而对RNA 中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。  

此外，试剂的稳定性、批间差、溯源性（是否溯源于WHO国际标准品）等也都是考察一款试剂盒质量重要指标。

体外诊断试剂是指采用免疫学、微生物学、分子生物学等原理或方法制备的、在体外用于对人类疾病的诊断、检测及流行病学调查等的诊断试剂，包括微生物抗原、人类基因检测、肿瘤标记物等等。我国对体外生物诊断试剂按药品进行管理，对体外化学及生化诊断试剂等其他类别的试剂则按医疗器械进行管理。这种分类管理的模式带来了一些问题：按照《药品管理法》及药品 GMP 认证的要求，按药品进行管理的体外诊断试剂生产企业必须通过 GMP 认证。部分企业由于产值较低，企业发展规模有限，根本无力申报 GMP 认证。SFDA 医疗器械司助理巡视员常永亨介绍说，自 2005 年起， SFDA 就把体外诊断试剂监管当作一项重点来抓，正探索全新的管理模式，已经着手起草新的管理办法，并在网上公开征求各界意见。此次邀请欧盟专家来华，也正是为了借鉴国际经验，做到科学监管，促进行业健康发展。据克里斯蒂 • 塔瑞佳介绍，美国、加拿大等国和欧盟一直都将体外诊断试剂归入器械类管理。欧洲委员会于 1998 年 10 月 27 日 正式通过了 98/79/EC 体外诊断器械指令（简称 IVDD 指令），并公告于 1998 年 12 月 7 日 的第 L331 号欧盟公报上。根据公报的内容，欧盟各成员国必须于 2000 年 6 月 7 日 之前完成执行本指令所需要的相关法规命令修制定与公告，自 2003 年 12 月起，所有在欧盟各成员国销售的体外诊断器械均须依照本指令完成符合性评价程序，贴上 CE 标记，才能在欧盟上市。根据欧盟的 IVDD 指令，体外诊断试剂是作为一类特殊产品单独管理的，在该指令附录 Ⅱ 中，目录 A 和目录 B 上的品种因风险级别较高而管理相对严格。除此之外，欧盟对其他大部分风险级别较低的产品实行自我管理，即制造商建立质量管理体系，保留技术文件，做自我保证声明，通常无需政府批准即可上市。各国管理体外诊断试剂的具体法规虽略有不同，但大体上都是根据风险管理的原则进行的，其对高风险的认定也比较一致，因为毕竟不同于药品和医疗器械，其主要应用于体外，大部分体外诊断试剂是一种风险程度比较低的产品， 80% 左右的产品不属于高风险级别，因此欧盟的这种管理模式相对容易，管理成本也低。